什么是转录组分析(什么是转录组测序分析中Unigene)

什么是转录组分析

转录组分析是指某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的mRNA产物的集合，包含了时间和空间的限定，是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带。

转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。 应用高通量技术进行转录组测序是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。mRNA的转录本表达分析，通过获得研究对象基因组转录区域的信息，鉴定转录发生位点，可变剪切等，其精确的计数方法更可对基因进行精确的定量分析。

什么是转录组测序分析中Unigene

简单地说， 高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列，是比较短的，叫read，它们是原始数据； 有很多reads通过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig； 多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold； 一个contig被组

“基因组”“蛋白组”“转录组”“代谢组”的异同？

基因组：以生物体所有的核酸为研究对象，狭义的基因组定义为生命体的全套DNA，广义的基因组则包含DNA、mRNA、lncRNA等参与到基因表达调控的所有核酸序列。其主要研究手段为基因测序，以华大基因为代表。转录组通常可认为是基因组的简化研究手段，即所有转录本的集合。

蛋白组：生物体基因组所编码的全套蛋白质。鉴于蛋白质表达的时空特异性，各组织器官或者特定亚细胞结构器（如线粒体、叶绿体），甚至是外泌蛋白，也可以成为一个蛋白组。所以蛋白质组是信号转导、分子发育最为直接的手段。其主要研究手段为生物质谱，在国内以牟合蛋白为典型。

代谢组：生物体内源性代谢物质的动态整体，通常只涉及相对分子质量约小于1000的小分子代谢物质。因其与蛋白质组一样可以很好的指针细胞、机体的生命活动状态，所以常常被用作临床生物标志物的筛选。目前，代谢组的研究也只能借助生物质谱完成。

下面这幅图能够很好的呈现基因、代谢、生命活动间的关系:

Figure. Genomic-Proteomic-Phenotype

时间序列的单细胞转录组数据分析

单细胞转录组数据分析在阐述多细胞生物发育与疾病进程方面已经开发了多种新的方法，如比较有名的轨迹推断(TI，trajectory inference)。但是，我们知道，各种轨迹推断方法只是一种利用表达量的排序手段而已，而且严重依赖先验的知识，如根节点的选择。有没有一种技术可以真正的在RNA转录的时候为转录的RNA打上时间的标签呢？

今天，就为大家介绍一种基于RNA代谢标记的单细胞分析方法：dynamo。我们发现当我们真的可以标记RNA新旧之后，其实基于数学上我们对时间的定义，可以开发出许多新的单细胞动力学模型。

单细胞RNA测序提供了整个转录组的快照，但掩盖了RNA生成动态。Qi Qiu等提出了一种单细胞代谢标记的新RNA标记测序(scNT-seq，基于微流控微孔板单细胞RNA标记技术为新格元商业化的DynaSCOPE技术)，一种用于大规模平行分析来自同一细胞的新转录和已存在mRNA的方法。该方法基于液滴微流体的方法能够在条形码珠上进行高通量化学转换，有效地用T-to-C替换标记新转录的mRNA。

Qi Qiu等在文章中的数据揭示了时间序列的转录因子活性和在单细胞水平上响应神经元激活的细胞状态轨迹。作者进一步确定了RNA生物发生和衰变的速率，以揭示在多能和罕见的全能双细胞胚胎(2C)干细胞状态之间逐步转换的RNA调控策略。最后，将RNA代谢标记与遗传扰动相结合，确定DNA甲基胞嘧啶双加氧酶作为进入like-2C细胞状态的表观遗传屏障。时间分辨率下的单细胞转录组分析，打开了关于细胞类型特异性RNA调节机制的新线索。

我们知道，RNA水平的动态变化是由RNA转录、加工和降解的相互作用调控的。因此，要了解转录组在不同功能细胞类型中调控的机制，需要对基因表达的时间动态进行细胞类型特异性测量。单细胞RNA测序(scRNA-Seq)的发展使人们对细胞类型和状态的异质性有了更全面的了解。然而，标准的scRNA-Seq方法捕获到的是新转录(“新”)和已存在(“旧”)RNA的混合物，而不能获得RNA的时间动态。

单细胞转录组测序，连同RNA速度(velocity )和代谢标记(metabolic labeling)方法，以前所未有的分辨率揭示细胞状态及其之间的转换关系。然而，充分利用这些数据需要开发出能够预测细胞命运并揭示调控机制的动态模型。在这里，python 分析工具dynamo是一个分析框架，整合固有的剪接与否和标记与否，以估计绝对的RNA速度，重建速度矢量场(vector fields )，以预测未来的细胞命运，并最终使用微分几何分析阐明潜在的调控网络。

在文章 Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq 中，作者将dynamo应用不同的生物学过程，包括预测分化造血干细胞谱系的未来状态，从细胞周期进程中糖皮质激素反应的反卷积、驱动斑马鱼色素沉着的调控网络的表征、确定对SARS-CoV-2感染的可能耐药性途径。

因此，基于RNA代谢标记的工作代表了从定性的、隐式的分化概念到定量和预测理论的重要一步探索。新模型的提出也为之前定性的和描述性质的单细胞数据分析朝着定量和预测迈出一大步。

开发dynamo的初心

在相同的转录本群体中区分新的和旧的RNA，常用的方法依赖于RNA代谢标记，利用外源性核苷类似物，如4-硫嘌呤(4sU)和标记RNA的生化富集。尽管这些方法对RNA动力学调控有重要的见解，但它们需要充足的起始材料，并对富集足够的细胞信号提出了挑战。最近发展了几种方法将4sU化学转化为胞嘧啶类似物，产生尿嘧啶-胞嘧啶复合物，在逆转录后标记新转录的RNA。这些化学方法允许直接测量细胞RNA的时间信息，而不需要生化富集。最近的研究表明，通过将Smart-Seq/plate-based scRNA-Seq与其中一种化学方法(如用于RNA代谢测序的巯基(SH)链烷基化)结合，可以在单细胞水平上联合分析新旧转录组。然而，这些基于Smart-Seq/plate的方法存在一些局限性。首先，它们成本高、耗时长，很难对高度异质性的细胞群进行大规模分析。其次，这些方法缺乏独特的分子标识符(UMIs)，无法准确定量新的转录水平。

为了克服这些限制，Qi Qiu等开发了scNT-Seq，一种基于UMI的高通量scRNA-Seq方法，结合了代谢RNA标记、液滴微流体和化学诱导的s4U到胞嘧啶模拟物的编码，同时测量来自同一细胞的新和旧转录组。作者证明，scNT-Seq能够在单细胞水平上对细胞RNA动力学、基因调控网络(GRN)活性和细胞状态轨迹进行时间分辨分析，同时它极大地提高了可扩展性并降低了成本。

Dynamo是一个python库，目前提供了一个完整的解决方案来分析传统scRNA-seq或基于scRNA-seq的时间代谢标记的动力学分析。它渴望成为持续集成机器学习、系统生物学、信息论、随机物理等最激动人心的发展的领先工具，以建模、理解和解释各种尖端单细胞基因组学技术生成的数据集(dynamo 2/3的开发正在进行中)。我们希望这些模型、理解和解释不仅能促进你的研究，而且最终可能导致新的生物学发现。

可以在单细胞分辨率下揭示细胞类型特异性TF调节活性的时间动态。

转录因子(TF)的调控活性可以通过将顺式调控序列与单细胞基因表达联系起来，以单细胞分辨率进行量化。通过scNT-Seq联合分析新的和旧的转录组，可以并行分析由外部刺激诱导的动态调控和与细胞特性相关的稳定调控。通过将单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)应用于成对的单细胞新/旧转录组。作者鉴定出79个协同调节的TF调控，且至少在一种细胞类型中具有显著的顺式调节基序富集。

最近的研究表明，基因表达的时间导数被称为“RNA velocity”，可以通过在scRNA-Seq数据集中区分未剪接(内含子reads)和剪接(外显子reads)的mrna来估计，并用于告知单个细胞的转录状态如何随时间(以小时为尺度)变化。我们首先检验了RNA velocity分析是否能够预测单个细胞在短暂(分钟)和持续(小时)神经元激活时的转录状态轨迹。因为代谢标记可以捕捉RNA水平的快速变化，而通过3 '标记的UMIs检测新的RNA在很大程度上独立于基因结构，我们推断，从scNT-Seq中对新RNA和总RNA的单细胞配对测量可以用来计算按标记时间(单位时间的分子)缩放的基于代谢标记的RNA velocity。作者根据富集靶基因的新转录RNA水平计算这些活性调节转录因子在每个细胞中的调控活性。通过将这些转录因子的调控活性投射到RNA velocity 流上，我们构建了一个针对不同类别转录因子的单细胞分辨率、时间分辨率的调控活性图谱。

通过将TimeLapse化学与高通量液滴微流体平台相结合，scNT-Seq能够共同分析同一细胞的新合成和已存在的转录组，在单细胞水平捕获mRNA的时间信息。传统的RNA速度分析使用内源性RNA剪接动力学来告知细胞的未来轨迹。因此，它受到RNA剪接时间不受控制和许多基因内含子reads稀少性的限制。由于代谢标记周期的时间和长度可以通过实验控制，在scNT-Seq中通过3 '标记的UMIs直接计数新的和旧的转录本，提供了一种无偏性的方法来计算所有可检测基因的RNA动力学参数。

使用计算模型明确地结合了基于代谢标记的单细胞测序，我们可以计算高度动态过程(数分钟或者数小时间)的时间分辨RNA速度。此外，在外部刺激或细胞状态转变期间，测量与TF相连接的靶基因的新RNA水平可以在单细胞水平上刻画TF调节活性。最后，通过脉冲追踪实验，scNT-Seq可以更准确地估计RNA动力学参数，揭示RNA调控策略在罕见细胞群体。

https://jef.works/blog/2020/01/14/rna_velocity_analysis_tutorial_tips/
https://www.kallistobus.tools/velocity_tutorial
https://velocyto.org/velocyto.py/index.html
https://pypi.org/project/scvelo/
https://dynamo-release.readthedocs.io/en/latest/index.html
https://github.com/wulabupenn/scNT-seq/tree/master/TC_calling
https://zhuanlan.zhihu.com/p/359100974
https://www.global-sci.org/intro/article_detail/csiam-am/18653.html
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.19.304584v1.full
https://zhuanlan.zhihu.com/p/351104418
RNA velocity, methods
La Manno et al (2018, Nature) [ steady-state model ] Implemented in velocyto
Bergen et al (2019, bioRxiv) [ dynamical model ] Implemented in scVelo
Soneson et al (2020 bioRxiv) finds that “preprocessing choices affect RNA velocity”
Velociraptor from Rue / Lun / Soneson uses basilisk to embed scVelo in R/Bioc:
https://github.com/kevinrue/velociraptor Works great !

本文来自网络，不代表生活常识网立场，转载请注明出处：http://sdsy56.com/shenghuozixun/398142.html

上一篇: 办理车贷必须车主本人在场吗

下一篇: 什么是转鼓指数(焦炭粉率对指标的影响···

声明： 我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本站部分文字与图片资源来自于网络，转载是出于传递更多信息之目的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们(管理员邮箱：15053971836@139.com)，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!